Se halla situada en el ángulo que forman el brazo norte de la nave del crucero y la nave lateral del Evangelio, ocupa los espacios de dos antiguas capillas del siglo XIV, la de Santa Ana y la de San Antolín juntamente con el espacio de una pequeña plaza situada detrás de las capillas.
El Obispo D. Luis de Acuña solicitó y obtuvo del Cabildo en 1477 estos espacios para edificar una capilla dedicada a la Inmaculada Concepción de María y destinada también a su enterramiento. La obra se ejecutó entre 1477 y 1483. El arquitecto que la inicia es Juan de Colonia y la concluye su hijo Simón. La arquitectura presenta formas y decoración de un elegante arte gótico florido en los arcos de entrada, capiteles y cornisas, pero sobre todo en sus bóvedas con nervios adornados de caireles.
Sus muros se hallan revestidos de sepulcros y retablos. A la entrada destaca el sepulcro de D. Fernando Díaz de Fuentepelayo, primer capellán y hombre de confianza de D. Luis. Es obra del gótico florido y ejemplar modelo para otros sepulcros de la catedral de finales del siglo XV. En él pudieron participar conjuntamente Simón de Colonia y Gil de Siloé. En el sepulcro destaca la magnífica estatua yacente y el relieve del nacimiento de Cristo.
En el muro del fondo, frente a la puerta, hay otro gran arco sepulcral de los familiares del obispo D. Luis, que aparecen en su heráldica, obra de los siglos XVI y XVII.
El retablo principal es la joya de la capilla. Se trata de una de las obras cumbres de la escultura tardo-gótica europea. Se debe a la gubia de Gil de Siloé, escultor gótico-flamenco, que lo realiza entre 1483 y 1486. La decoración, el estofado y policromía son obra del pintor burgalés Diego de la Cruz, su colaborador.