El Retablo Mayor se corresponde con el periodo clásico en su plenitud. La obra arquitectónica y escultórica fue planeada y dirigida por los hermanos Rodrigo y Martín de la Haya en colaboración con otros artistas como Juan de Anchieta y Domingo de Berriz. En la policromía trabajaron los pintores Gregorio Martínez y Diego de Urbina. El ensamblaje arquitectónico del retablo emplea los tres órdenes clásicos: dórico, jónico y corintio, y se divide en tres calles y cuatro entrecalles o intercolumnios, divididos a su vez en cuatro cuerpos en las calles y en tres en las entrecalles. Está dedicado principalmente a la Virgen y tienen relevancia la Eucaristía y el santoral.

En el centro del primer cuerpo se halla el sagrario, todo él decorado con relieves alusivos a la Eucaristía, obra de Domingo de Berriz. En el segundo cuerpo se halla la imagen de Santa María la Mayor, patrona de la ciudad de Burgos, una magnífica obra de platería del siglo XV, que pagó el obispo D. Luis de Acuña. En el tercer y cuarto cuerpo se hallan los grupos de la Asunción de la Virgen a los cielos y la Coronación, talladas por Juan de Anchieta. En la calle lateral, de arriba abajo, se representan magníficos relieves:  Santa Ana, la Virgen y el Niño y el abrazo de Joaquín y Ana ante la puerta dorada del templo, el nacimiento de la Virgen y su presentación en el templo. En el lateral derecho, también de arriba abajo, aparecen Santa Isabel con su hijo Juan niño y la Virgen María con el Niño Jesús; siguen la Anunciación del ángel a María, la Visitación de la Virgen a su prima Isabel y la Presentación del Niño Jesús en el templo. En los intercolumnios se halla el Apostolado y en la culminación los Evangelistas, los Arcángeles custodios y la Crucifixión o Calvario.