Pasado el trascoro y situados ya en la nave lateral norte, llegamos a la Capilla de Santa Ana.

Situada en el ángulo que forman el brazo norte de la nave del crucero y la nave lateral del Evangelio, ocupa los espacios de dos antiguas capillas del siglo XIV, la de Santa Ana y la de San Antolín juntamente con el espacio de una pequeña plaza, que estaba situada detrás de las capillas.

El Obispo D. Luis de Acuña solicitó y obtuvo del Cabildo en 1477 estos espacios para edificar una capilla dedicada a la Inmaculada Concepción de María y destinada también para su enterramiento. La obra se ejecutó entre 1477 y 1483. El arquitecto que la inicia es Juan de Colonia y la concluye su hijo Simón. La arquitectura presenta formas y decoración de un elegante arte gótico florido en los arcos de entrada, capiteles y cornisas, pero sobre todo en sus bóvedas con nervios adornados de caireles.

Sus muros se hallan revestidos de sepulcros y retablos. A la entrada destaca el sepulcro de D. Fernando Díaz de Fuentepelayo, primer capellán y hombre de confianza de D. Luis. Es obra del gótico florido y sirve de modelo para otros sepulcros de la catedral de finales del siglo XV. En él pudieron participar conjuntamente Simón de Colonia y Gil de Siloé. En el sepulcro destaca la magnífica estatua yacente y el relieve del nacimiento de Cristo.

En el muro del fondo, frente a la puerta, hay otro gran arco sepulcral de los familiares del obispo D. Luis, que aparecen en su heráldica, obra de los siglos XVI y XVII.

El retablo principal es la joya de la capilla. Se trata de una de las obras cumbres de la escultura tardo-gótica europea. Se debe a la gubia de Gil de Siloé, escultor gótico-flamenco, que lo realiza entre 1483 y 1486. La decoración, el estofado y policromía son obra del pintor burgalés Diego de la Cruz, su colaborador.

El retablo de esta Capilla

El retablo se compone de tres calles separadas por pilastras-pináculos, con gran número de esculturas y culmina con un calvario. Presenta en la calle central la genealogía humano-divina de Cristo que se inicia en el tronco de Jesé y, a través del simbólico abrazo de Joaquín y Ana en el centro, culmina con la imagen de María con el Niño en sus brazos.

En las calles laterales, más estrechas, a la izquierda vemos al obispo Acuña, orante, el Nacimiento de la Virgen y los desposorios de María y José. A la derecha se pueden ver San Huberto como cazador, la Presentación de María en el templo y la aparición del ángel a San Joaquín. Por último, en la predela, vemos a Cristo resucitado que se aparece a las mujeres, San Pedro y San Pablo y los cuatro evangelistas.

En el centro de la capilla se halla el sepulcro de su fundador, tallado en fino alabastro por Diego de Siloé en 1519. Destaca la estatua yacente por lo delicado de su talla y realismo así como el pedestal, adornado con bajorrelieves de las virtudes cardinales y teologales y escudos del fundador. Está inspirado y es casi una copia del pedestal del Papa Sixto IV, que se halla en los museos vaticanos.

También hay que destacar el retablito de Santa Ana, obra en piedra y madera, de Diego de Siloé, ejecutado  en 1522. Es admirable el grupo de Santa Ana triple en el nicho central.

La entrada de la capilla se protege con interesante reja, obra gótica en hierro forjado y dorado por el rejero palentino Luis Paredes en 1495. En la parte alta destaca el escudo del fundador protegido por grifos rampantes.

En lo alto del muro oeste, a la izquierda según se entra, cuelgan dos cuadros: El de la Sagrada Familia, óleo sobre tabla, que es obra de un pintor que copia una composición original de Andrea del Sarto hacia 1530 y destaca por su delicadeza y serenidad, y el de San Bartolomé, óleo sobre lienzo, cuya luz resalta la figura del apóstol y se cree obra del pintor Aguilar, del 1650. Junto a los cuadros se han colocado tres vitrinas que muestran ornamentos litúrgicos de terciopelo y brocados con bandas bordadas de los siglos XV y XVI.
En la parte alta se halla un tapiz de la serie teológica «Lucha de los Vicios y Virtudes y triunfo de Cristo sobre el pecado y la muerte», una extraordinaria obra gótico-flamenca de comienzos del siglo XVI.

Finalmente en la capilla hay dos retablos neogóticos, realizados por Antonio Lanzuela durante la restauración llevada a cabo en la capilla con el patrocinio del duque de Abrantes entre 1868 y 1870.